光學(xué)显微镜
2024-04-12(1056)次浏览
光學(xué)显微镜使用(yòng)可(kě)见光进行照明,用(yòng)光學(xué)透镜进行聚焦,人眼或者 CCD/CMOS 相机进行观察。基本的明场照明显微镜由光源,目镜,物(wù)镜,载物(wù)台,聚光镜,光圈等部件组成。收到衍射效应的限制,光學(xué)显微镜的分(fēn)辨率极限, 其中 NA 是数值孔径(Numerical Aperture),為(wèi)物(wù)镜与样品间介质折射率以及孔径角正弦值的乘积 ,是光學(xué)显微镜重要的参数之一。阿贝极限将光學(xué)显微镜的分(fēn)辨率限制在约200纳米处。 為(wèi)了提高显微镜的成像素质,扩展应用(yòng)范围,光學(xué)显微镜经过不断的发展改进,已经成為(wèi)一个庞大的家族。
成像手段:普通宽场成像 (Wide field) :光學(xué)显微镜基本的成像光路全内反射荧光(TIRF):利用(yòng)光在介质界面发生全反射,在表面形成倏逝波的特性,只对样品表面 200nm 左右深度内进行成像,隔绝来自焦外光線(xiàn)的干扰。共聚焦(Confocal):利用(yòng)空间针孔对焦外光線(xiàn)进行隔绝,对样品进行逐点扫描成像,大大提高z轴分(fēn)辨率。多(duō)光子(Multi-Photon):利用(yòng)長(cháng)波長(cháng)的光波绕射能(néng)力强,穿透能(néng)力高的特性,让荧光分(fēn)子同时吸收多(duō)个長(cháng)波長(cháng)光子激发短波長(cháng)荧光,从而实现使用(yòng)较低能(néng)量的光照来对厚样品成像。目前成像的深度已经达到毫米级别。光片 (Light sheet):对垂直于物(wù)镜光轴的切片进行照明,避免了对焦外部分(fēn)样品的照明,大大提高z轴分(fēn)辨率,同时相对 confocal 成像速度更高。结构光 (Structured light):将照明光进行正弦调制或其它形式的调制形成结构光照明,与样品表面形成摩尔纹,使得一部分(fēn)高频信息能(néng)够被观察到。这种方法高能(néng)够提升两倍的分(fēn)辨率,属于一种超分(fēn)辨技术。受激发射损耗 (Stimulated Emission Depletion, STED):荧光显微镜中,激发光由于衍射效应,在样品上形成的是一个亮斑,亮斑内的荧光分(fēn)子均被激发产生荧光,STED在激发光上嵌套一个环形光,使对应环形區(qū)域的分(fēn)子发生受激辐射而不产生荧光,只有(yǒu)中心區(qū)域分(fēn)子产生荧光,从而突破衍射极限限制的分(fēn)辨率。STED的分(fēn)辨率可(kě)以达到30nm左右。随机光學(xué)重构 (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM):随机激发单个荧光分(fēn)子,对其光斑进行拟合得到中心分(fēn)子的位置,不断随机激发分(fēn)子并将得到的图案叠加,得到超越衍射极限分(fēn)辨率的图像。STORM的分(fēn)辨率可(kě)以达到20nm左右。
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